结直肠癌（CRC）为常见癌症之一，由于肿瘤的滚动和复发，CRC逝世率居高不下。结直肠癌的发生和发展波及一系列的基因和表不雅遗传改动，还受肿瘤免疫微环境（TIME）影响。固然刻下结直肠癌的化疗和免疫颐养赢得了很猛发扬白鹿 ai换脸，但患者预后并不睬思。免疫查验点阻断（ICB）颐养仅对一小部分结直肠癌患者有意，而识别CRC内在事件调理免疫查验点阻断疗效的需求尚未得到满足。因此，为了修复新的抗结直肠癌免疫颐养计谋，需求教结直肠癌内源性事件与宿主免疫反馈之间的串扰。

N6-甲基腺苷（m6A）RNA修饰是肿瘤生物学中的一种表型调控机制，为信使RNA（mRNA）中最丰富的修饰，调理mRNA的剪接、降解和翻译。m6A修饰由m6A writers（甲基化滚动酶）Mettl3/Mettl14/WTAP和m6A eraser （去甲基化酶）AKBH5/FTO动态调理。m6A reader（结合卵白），如YTHDF1/2/3、YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3，不错径直与m6A修饰的mRNA结合，导致mRNA剪接、输出、清爽性和翻译的改动。但刻下m6A修饰对肿瘤免疫微环境 （TIME）的潜在影响仍不了了。

近日来自香港汉文大学于君团队发现ALKBH同源物5 （ALKBH5）能出手免疫扼制，是促进结直肠癌 ICB 颐养的分子靶点。该盘问于2023年5月发表于杂志《Gastroenterology》，题为“ALKBH5 Drives Immune Suppression via targeting AXIN2 to Promote Colorectal Cancer and is a Target for Boosting Immunotherapy.”

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图源：《Gastroenterology》

ALKBH5与结直肠癌患者预后不良相干

为评价ALKBH5的临床真谛，作家对205例结直肠癌患者ALKBH5卵白抒发进行检测。Kaplan Meier弧线清楚ALKBH5卵白高抒发与总生涯率差相干。愚弄多身分COX追忆分析ALKBH5的抒发与性别、年齿、肿瘤部位、TNM分期等其他危急身分对结直肠癌预后的影响。罢休标明，ALKBH5卵白高抒发是结直肠癌患者预后不良的颓落身分，且ALKBH5的mRNA高抒发预示着结直肠癌患者的总体生涯率较低。多变量COX追忆分析阐发ALKBH5是结直肠癌预后不良的颓落身分（图1A）。

ALKBH5缺失

引诱小鼠结直肠癌移植瘤模子的免疫扼制

为了盘问ALKBH5介导的m6A修饰是否调理结直肠癌免疫微环境，作家构建了2个清爽的ALKBH5基因敲除的小鼠结直肠癌细胞（MC38和CT26）。MTT法阐发千里默ALKBH5可扼制MC38和CT26细胞的体外孕育（图1B）。默示ALKBH5在结直肠癌中的抒发可能调理抗肿瘤免疫反馈。

接下来，盘问东说念主员通过多色流式细胞术盘问ALKBH5是否改动了小鼠的免疫细胞构成。在MC38同基因小鼠模子中，ALKBH5基因敲除权贵镌汰了肿瘤体积和分量（图1C）。在ALKBH5症结的肿瘤中不雅察到权贵减少的骨髓源性扼制细胞（MDSCs）浸透，包括单核细胞MDSCs和粒细胞MDSCs，以及增多的NK和CD8+T细胞群（图1D）。且在CT26同基因模子中，ALKBH5的缺失权贵扼制了肿瘤的孕育，并增强了抗肿瘤免疫反馈（图1E和F）。免疫荧光染色阐发ALKBH5缺失的MC38和CT26肿瘤中MDSCs的浸润减少（图1G）。因此，ALKBH5通过调理MDSCs在结直肠癌中的浸透来调理免疫扼制。

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图1.ALKBH5瞻望结直肠癌患者的不良预后，并调理小鼠结直肠癌中免疫细胞的浸透

东说念主结直肠癌细胞ALKBH5基因敲除

促进CD34＋东说念主源化小鼠的抗肿瘤免疫

接下来，为了考据ALKBH5对东说念主结直肠癌的免疫扼制作用，作家构建了CD34＋东说念主源化小鼠模子，以模拟小鼠的东说念主类免疫系统。免疫低下的NSG小鼠在全身γ射线照耀后，经尾静脉打针东说念主CD34＋造血干细胞，16周后只吸收东说念主CD45＋细胞>25%的小鼠（图2A）。将佩带/不佩带ALKBH5基因敲除的HCT116细胞植入东说念主源化CD34＋小鼠体内。罢休发现，ALKBH5基因敲除权贵扼制了东说念主源化CD34＋小鼠的肿瘤孕育（图2B）。

之后作家分析了同种异体CRC移植在东说念主源化CD34＋小鼠体内的免疫细胞浸透情况。MDSCs、NK细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的门控如图2C所示，罢休标明ALKBH5基因敲除的肿瘤清楚MDSCs减少，但NK细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的浸透增多（图2D），阐发ALKBH5引诱了东说念主类结直肠癌的免疫扼制。通过免疫组化染色也发现ALKBH5的高抒发与东说念主原发结直肠癌组织中CD8＋T细胞的低浸透相干（图2E）。以上罢休标明ALKBH5有助于东说念主类结直肠癌的免疫扼制微环境。

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图2.东说念主类结直肠癌细胞中的ALKBH5扼制抗肿瘤免疫

AXIN2信使RNA为ALKBH5介导的m6A去甲基化的靶点白鹿 ai换脸

接下来作家进一步对ALKBH5若何促进结直肠癌孕育和扼制抗肿瘤免疫进行盘问，以探索其作用的分子基础。由于ALKBH5使m6A修饰的mRNA去甲基化，盘问东说念主员通过调控ALKBH5抒发后检测CRC细胞中举座m6A的水平。罢休清楚ALKBH5缺失的HCT116和SW1116细胞中举座m6A水平增多，而ALKBH5的过抒发镌汰了总m6A水平。为了揭示ALKBH5的卑劣靶点，盘问东说念主员在ALKBH5被敲除/未敲除的HCT116细胞中进行了MERIP-seq和RNA-seq（图3A）。在ALKBH5基因敲除后，通过RNA-seq步骤闭塞了73个上调基因和51个下调基因，过度抒发分析标明，互异抒发基因主要皆集在Wnt/β-Catenin信号转导中（图3B）。接下来，作家分析了基于MERIP-seq的m6A竖立文献。与对照比较，ALKBH5基因敲除增多了可检测到的m6A峰的数目（图3C）。盘问东说念主员在HCT116-shNC中检测到11，942个m6A峰，在HCT116-shALKBH5中检测到13，514个m6A峰（图3C）。ALKBH5缺失导致356个基因中m6A水平权贵增多（图3D）。为了细则ALKBH5-m6A轴的卑劣靶点，作家重迭了从MERIP-seq和RNA-seq中细则的候选基因（图3E），并发现了5个潜在的ALKBH5卑劣靶点（AXIN2、RGMB、NGFR、C1orf116和ARL4C）（图3F）。其中，在HCT116和SW1116细胞中，AXIN2在ALKBH5被敲除后合手续被引诱抒发（图3G）。因此，AXIN2可能是ALKBH5在结直肠癌细胞中的径直靶点。此外，m6A免疫千里淀和RT-PCR标明，ALKBH5的缺失增多了东说念主结肠癌细胞系（HCT116和SW1116）和小鼠结直肠癌细胞系（MC38和CT26）中AXIN2 mRNA的m6A水平；相背，ALKBH5过抒发镌汰了HCT116和MC38细胞AXIN2 mRNA上的m6A水平（图3H）。接下来作家猜思ALKBH5是否能径直与AXIN2 mRNA结合。为此，在HCT116和MC38细胞中进行了抗ALKBH5抗体的RNA免疫千里淀，揭示了ALKBH5和AXIN2 mRNA之间的径直互相作用（图3I）。综上标明ALKBH5与AXIN2 mRNA结合，使m6A符号去甲基化。

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图3.AXIN2细则为ALKBH5的候选靶点

ALKBH5阻滞IGF2BP1介导的AXIN2 mRNA的清爽性

之后，作家推敲了ALKBH5是否以及若何影响结直肠癌中AXIN2的抒发。盘问东说念主员发现，在ALKBH5缺失的CRC细胞中，AXIN2的mRNA和卵白抒发均权贵增多（图4A），而其抒发被ALKBH5过抒发扼制（图4B）。鉴于m6A修饰对mRNA衰变有权贵影响，作家假定ALKBH5不错调理AXIN2 mRNA的清爽性。罢休清楚ALKBH5缺失确乎清爽了AXIN2 mRNA，而ALKBH5过抒发则产生相背的恶果（图4C）。为了揭示介导ALKBH5引诱的mRNA降解的m6A readers，盘问东说念主员在HCT116细胞中敲除了m6A readers（YTHDF1/2/3、YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3）的抒发，发现独一IGF2BP1敲低权贵扼制了AXIN2 mRNA和卵白的抒发；此外，抗IGF2BP1抗体的RNA免疫千里淀实考据实了HCT116和MC38细胞中IGF2BP1和AXIN2 mRNA之间的径直互相作用（图4D）。终末，在CRC队伍I中ALKBH5和AXIN2在卵白水平上的抒发以及队伍II的mRNA水平都呈负相干（图4E）。要而言之，这些数据标明ALKBH5使AXIN2 mRNA的m6A去甲基化，从而镌汰IGF2BP1介导的AXIN2 mRNA清爽性。

ALKBH5在结直肠癌中

引诱m6A-AXIN2-β-Catenin轴的抒发

AXIN2当作β-Catenin阻滞复合体中的支架卵白，促进β-Catenin的降解。由于在RNA-seq分析中，Wnt/β-Catenin被细则为ALKBH5缺失调理的最高信号通路（图3B），作家假定ALKBH5可能通过扼制AXIN2而激活扣直肠癌中的Wnt信号。HCT116和SW1116细胞中的ALKBH5基因敲除减少了核β-Catenin的抒发；Wnt/β-Catenin信号的两个转录靶点MYC和Cyclin D1的抒发在ALKBH5被敲除后权贵镌汰；反之，ALKBH5过抒发引诱MYC和细胞周期卵白D1的抒发（图4F）。ALKBH5基因敲除也扼制了MC38和CT26细胞中活性β-Catenin、MYC和细胞周期卵白D1的抒发，而在MC38细胞中过抒发ALKBH5则起到相背的作用（图4G）。

为了考据AXIN2是ALKBH5和Wnt/β-Catenin信号之间的分子勾通，盘问东说念主员在ALKBH5过抒发的HCT116和MC38细胞中外源导入了AXIN2。AXIN2的再行抒发排斥了ALKBH5促进β-Catenin抒发和CRC细胞孕育的作用（图4H）。且独一野生型（WT）ALKBH5而非突变的ALKBH5，不错扼制AXIN2的抒发，并在内源性ALKBH5缺失的情况下收复HCT116和SW1116细胞中活性的β-Catenin，这意味着ALKBH5以m6A依赖的阵势引诱Wnt/β-Catenin信号转导；一样WT ALKBH5而非突变的ALKBH5援助了ALKBH5基因敲除引起的增殖症结（图4I）。综上罢休解说ALKBH5通过m6A-AXIN2-β-Catenin轴促进CRC。

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图4.ALKBH5通过径直调理AXIN2 mRNA的m6A水平，促进结直肠癌Wnt/β-Catenin信号转导

ALKBH5在结直肠癌中引诱Wnt靶基因DKK1

WNT信号是肿瘤免疫反馈的主要调理因子。RNA-seq清楚，Wnt/β-Catenin信号的卑劣转录基因Dickkopf相干卵白1（DKK1）是ALKBH5基因敲除的最高扼制基因（图5A）。ALKBH5缺失机，在东说念主（HCT116和SW1116）和小鼠CRC细胞系（MC38和CT26）中不雅察到DKK1在mRNA和卵白水平的抒发减少，而ALKBH5的过抒发则起到相背的作用（图5B）。由于AXIN2不错扼制Wnt/β-Catenin信号的激活，因此作家盘问了AXIN2是否不错调理DKK1的抒发。盘问发现AXIN2的再行抒发扼制了ALKBH5对DKK1的引诱，这意味着ALKBH5通过AXIN2促进了DKK1的抒发（图5C）。与此一致，在队伍I和队伍II的大肠癌中，ALKBH5和DKK1的抒发呈权贵正相干（图5D）。DKK1是一种分泌性卵白，盘问东说念主员进一步检测了CRC条目培养液中DKK1的水平。发现去除ALKBH5权贵镌汰了东说念主（HCT116和SW1116）和小鼠CRC细胞系（MC38和CT26）条目培养液中DKK1的水平（图5E），以及佩带MC38肿瘤的小鼠血清中的DKK1水平（图5F）。相背，过抒发ALKBH5则产生相背的恶果（图5E和F）。综上，ALKBH5通过m6A-AXIN2-β-Catenin轴共同促进DKK1在结直肠癌中的抒发。

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图5.ALKBH5通过引诱结直肠癌细胞外分泌DKK1

引诱MDSCs积贮

ALKBH5通过DKK1促进骨髓源性扼制细胞召募

DKK1已被报说念与MDSCs相接关连。作家推测ALKBH5可能引诱DKK1分泌在结直肠癌中招募MDSCs。为此，从同基因小鼠结直肠癌模子等分辨出脾MDSCs，将纯化MDSCs与ALKBH5缺失/未缺失的小鼠CRC细胞共培养（图5G）。发现与对照组比较，来自ALKBH5基因敲除的MC38或CT26的条目培养液眩惑MDSCs迁徙的才略镌汰，而这种互异可通过补充重组DKK1卵白（RDKK1）来排斥，且重组DKK1以剂量依赖的阵势促进MDSC迁徙（图5H）。因此，ALKBH5可引诱DKK1抒发以召募MDSCs。

接下来作家估计ALKBH5是否影响MDSCs的功能。为此，盘问东说念主员检测了添加/不添加rDKK1培养的离体脾MDSCs和从添加/不添加ALKBH5的MC38同种异体移植物等分辨的肿瘤浸润性MDSCs的功能标志（图5G）。罢休发现，在肿瘤浸润性MDSCs中，ALKBH5基因敲除后，MDSCs的两个功能标志物引诱型一氧化氮合酶（iNOS）和Arg1的抒发权贵镌汰。此外，在培养上清液中添加rDKK1可增多MDSCs中iNOS和Arg1的抒发（图5I）。为了考据DKK1在介导ALKBH5引诱的免疫扼制中的功能迫切性，在体内用抗DKK1抗体中庸DKK1。肿瘤长到50~100 mm3后，隔天腹腔打针DKK1中庸抗体，发现抗DKK1颐养取消了ALKBH5对肿瘤孕育和MDSC浸润的促进作用，伴跟着肿瘤中NK细胞和CD8+ T细胞的收复（图5J-K）。因此，ALKBH5引诱DKK1抒发，将免疫扼制的MDSCs召募到结直肠癌肿瘤微环境中。

肠说念特异性Alkbh5敲入卵白促进小鼠结直肠肿瘤发生并扼制抗肿瘤免疫

为了阐发ALKBH5在自愿性结直肠肿瘤发生中的作用，盘问东说念主员栽培了肠说念特异性ALKBH5敲入卵白（Alkbh5 KI）小鼠，Alkbh5 KI小鼠过火WT幼鼠被赐与偶氮氧甲烷加DSS以触发肿瘤变成（图6A）。最终，与WT同窝小鼠比较，Alkbh5 KI小鼠的肿瘤负荷更高且肿瘤更大（图6B）。Ki-67染色罢休清楚，与WT比较，Alkbh5 KI小鼠肿瘤和肠隐窝中增殖细胞比例增多 （图6C）。TIME方面，与WT小鼠比较，Alkbh5 KI小鼠肿瘤中MDSC浸润增多，伴跟着NK和CD8+T细胞的权贵减少（图6D）。免疫荧光染色阐发在Alkbh5 KI小鼠起原的肿瘤中有昭着的MDSCs积贮（图6E）。此外，与WT小鼠比较，Alkbh5 KI小鼠的肿瘤清楚AXIN2抒发减少，但活性β-Catenin和DKK1卵白抒发增多（图6F）。这些罢休标明，Alkbh5通过m6A-AXIN2-WNT-DKK1轴促进免疫扼制的肿瘤微环境进而促进结直肠癌的发生。

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图6.Alkbh5促进肠说念特异性Alkbh5敲入（KI）小鼠的结肠癌发生并扼制抗肿瘤免疫

靶向ALKBH5或DKK1增强

抗PD1颐养对结直肠癌的扼制作用

鉴于ALKBH5引诱DKK1分泌招募扼制性MDSCs以收缩抗结直肠癌免疫反馈，作家盘问了靶向ALKBH5或DKK1是否不错擢升抗PD1颐养的疗效。为了在体内靶向ALKBH5，盘问东说念主员使用团队研发的VNP系统将特定的ALKBH5-siRNA运输到肿瘤中，之后用VNP-siNC或VNP-siALKBH5颐养MC38同基因肿瘤模子，赐与/不赐与抗PD1颐养，罢休发现与VNP-siNC比较，VNP-siALKBH5权贵扼制了MC38同种异体移植物的孕育，且VNP-siALKBH5和解抗PD1颐养对MC38同种异体移植物的孕育扼制作用最强（图7A和B）。VNP-siALKBH5和解抗PD1颐养权贵减少了MDSCs在肿瘤内的相接，而CD8+T细胞和NK细胞的浸润增多（图7C）。此外，和解颐养组的MC38同种异体移植物中颗粒酶B+、肿瘤坏死因子α+和侵扰素γ+ CD8+T细胞的抒发水平最高（图7D）。因此，靶向ALKBH5可增强免疫查验点阻断颐养结直肠癌的疗效。

接下来，作家推敲了阻断DKK1是否也增强了抗PD1颐养的疗效。吸收抗DKK1、抗PD1或组合颐养MC38肿瘤，与对照组比较，抗DKK1或抗PD1颐养均权贵扼制肿瘤体积和分量，而组合颐养对肿瘤的扼制作用最强（图7E和F）。与对照组比较，和解愚弄抗DKK1和抗PD1可权贵减少MC38同种异体移植物中的MDSCs，增多CD8+T细胞和NK细胞的浸润（图7G），且组合颐养引诱了最强的抗肿瘤免疫反馈（图7H）。因此，抗DKK1抗体可增强结直肠癌抗拒PD1抗体的颐养反馈。

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图7.VNP-siALKBH5/抗DKK1加抗PD-1和解颐养可协同扼制过抒发ALKBH5的MC38异体移植物的孕育

总

结

总的来说，本盘问发现结直肠癌中ALKBH5的抒发通过m6A-AXIN2-WNT-DKK1轴招募骨髓源性扼制细胞，扼制抗肿瘤CD8+ T和当然杀伤细胞的浸透。领导靶向ALKBH5或DKK1可再行激活抗肿瘤免疫，并与抗PD1免疫查验点阻断颐养协同扼制结直肠癌孕育。此外发当今多个结直肠癌患者队伍中，ALKBH5的高抒发与预后不良相干，ALKBH5可能是判断结直肠癌患者预后的潜在标的。

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全文总结图

Zhai J， Chen H， Wong CC， Peng Y， Gou H， Zhang J， Pan Y， Chen D， Lin Y， Wang S， Kang W， To KF， Chen Z， Nie Y， He HH， Sung JJ， Yu J. ALKBH5 Drives Immune Suppression Via Targeting AXIN2 to Promote Colorectal Cancer and Is a Target for Boosting Immunotherapy. Gastroenterology. 2023 Aug;165(2):445-462.

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本文作家

杨亚莲

中国药科大学 药理学硕士白鹿 ai换脸